Vplyv nádorových mutácií RNA zostrihových faktorov PUF60 a U2AF65 na selekciu 3′ zostrihových miest
Ivana Borovská, Jana Královičová
APVV-18-0096, VEGA 2/0057/18
RNA zostrih je jedným z kľúčových procesov pre správnu produkciu proteínov a zároveň predstavuje príležitosť pre tvorbu proteínovej diverzity. Je zabezpečovaný zostrihovým aparátom, komplexom pozostávajúcim z viac ako 100 proteínov a regulačných RNA. Mnohé štúdie nádorových buniek, použitím metódy sekvenovania novej generácie, identifikovali medzi inými aj mutácie v rôznych zostrihových faktoroch (ZF). Jednými z nich sú U2AF65 a PUF60, ktoré sú zapojené v interakcii s prekurzorovou mRNA a plnia významnú úlohu v rozpoznávaní 3′ zostrihových miest. Oba proteíny preferenčne interagujú so sekvenciami bohatými na uridín a to prostredníctvom svojich RRM domén. V našej práci sme sa zamerali na analýzu 36 nukleotidových substitúcii v RRM doménach uvedených zostrihových faktorov, ktoré boli identifikované u pacientov s rôznymi typmi nádorov. Našim cieľom bolo určiť, ktoré varianty postihujú selekciu zostrihových miest a molekulové vlastnosti týchto proteínov. Použitím molekulárno-biochemických metód sme zistili, že 43% (10/23) U2AF65 a 15% (2/13) PUF60 nezávislých RRM mutácií spôsobovalo zostrihový defekt. Zároveň sme stanovili aminokyselinové pozície, ktoré sú nevyhnutné pre správne skladanie a stabilitu analyzovaných ZF. Tieto výsledky umožnili identifikovať nové aminokyselinové reziduá v RRM doménach, ktoré sú kritické pre selekciu 3′ zostrihových miest a zároveň vytvoriť relatívne jednoduchý nástroj na testovanie nových nádorových variant v RRM doménach uvedených ZF.
KRÁLOVIČOVÁ, Jana* – BOROVSKÁ, Ivana* – KUBÍČKOVÁ, Monika – LUKAVSKÝ, Peter J. – VOŘECHOVSKÝ, Igor**. Cancer-Associated Substitutions in RNA Recognition Motifs of PUF60 and U2AF65 Reveal Residues Required for Correct Folding and 3 ‚ Splice-Site Selection. In Cancers, 2020, vol. 12, no. 7, art. no. 1865. (2019: 6.126 – IF, Q1 – JCR, 1.938 – SJR, Q1 – SJR). ISSN 2072-6694.
Efektivita dvoch značkovačov bunkovej proliferácie v mozgu spevavca zebričky červenozobej
Ľubica Kubíková, Justína Polomová, Viktória Mikulášková a Kristína Lukáčová
APVV-15-0077, VEGA 2/0068/20
V neurovedách sa používajú značkovače bunkového delenia 5-bromo-2‘-deoxyuridín (BrdU) a 5-etinyl-2‘-deoxyuridín (EdU) často u toho istého jedinca pre označenie neuronálnych populácií vznikajúcich v rôznych obdobiach, ich migrácie a inkorporácie. V tejto štúdii sme sledovali efektivitu značkovačov BrdU a EdU v neurogénnej ventrikulárnej zóne mozgu spevavca zebričky červenozobej. Zistili sme, že ekvimolárne dávky BrdU a EdU neoznačia rovnaké množstvo buniek a BrdU je efektívnejší. Pri použití dávok 10-225 mg/kg BrdU a ekvimolárnych dávok EdU nastala saturácia počtu detegovaných buniek pri dávke 50 mg/kg BrdU a viac ako 41 mg/kg EdU. Tieto výsledky ukazujú, že oba značkovače sú spoľahlivé pre detekciu proliferujúcich buniek v mozgu vtákov, ale počty buniek označených BrdU a EdU nemôžu byť porovnávané.
KUBÍKOVÁ, Ľubica* – POLOMOVÁ, Justína* – MIKULÁŠKOVÁ, Viktória – LUKÁČOVÁ, Kristína. Effectivity of Two Cell Proliferation Markers in Brain of a Songbird Zebra Finch. In Biology-Basel, 2020, vol.9, no. 11, art.no. 356. (2019: 3.796 – IF, Q1 – JCR, 1.739 – SJR, Q1 – SJR).
Zlepšuje príjem bylín a zinku diétou antioxidačný a minerálny status jahniat s parazitárnou infekciou?
Klaudia Čobanová, Zora Váradyová, Ľubomíra Grešáková, Katarína Kucková, Dominika Mravčáková
APVV-17-0297, APVV-18-0131
Parazitárna infekcia spôsobená nematódami Haemonchus contortus je spojená so zvýšenou tvorbou reaktívnych foriem kyslíka, zmenami v aktivite antioxidačných enzýmov, poruchou minerálneho metabolizmu a absorpcie živín. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či príjem bylinnej zmesi s preukázanými antiparazitárnymi účínkami a/alebo organického zinku môže zmierniť oxidačný stres spôsobený infekciou. Suplementácia diét medicinálnymi rastlinami mala za následok zvýšenie aktivity katalázy v tkanivách, zatiaľ čo príjem Zn zvýšil aktivitu superoxid dismutázy v sliznici čreva. Príjem oboch aditív zlepšil celkovú antioxidačnú kapacitu tkanív. Príjem medicinálnych rastlín nemal negatívny vplyv na absorpciu mikroelementov (Zn, Cu, Mn, Fe) u infikovaných jahniat. Zaznamenali sme zvýšenie hladiny Zn v sére a pečeni, ako aj koncentrácie Cu v sliznici duodena u zvierat dostávajúcich organický zinok. Výsledky naznačujú, že doplnenie krmiva zmesou medicinálnych rastlín obsahujúcich bioaktívne zlúčeniny a/alebo organickým zdrojom zinku môže zmierniť nepriaznivé účinky parazitárnej infekcie stimuláciou antioxidačného obranného systému u prežúvavcov.
ČOBANOVÁ, Klaudia** – VÁRADYOVÁ, Zora – GREŠÁKOVÁ, Ľubomíra – KUCKOVÁ, Katarína – MRAVČÁKOVÁ, Dominika – VÁRADY, Marián**. Does Herbal and/or Zinc Dietary Supplementation Improve the Antioxidant and Mineral Status of Lambs with Parasite Infection? In Antioxidants, 2020, vol. 9, no. 12, art. no 1172. (2019: 5.014 – IF, Q1 – JCR, 1.100 – SJR, Q1 – SJR). ISSN 2076-3921.
Funkčné potraviny na báze kozieho mlieka a ich prospešnosť pre zdravie
Andrea Lauková, Monika Pogány Simonová, Valentína Focková, Jana Ščerbová, Eva Bino, Anna Kandričáková
APVV-17-0028, APVV SK-PT-18-0005
Doposiaľ dostupné zdroje o mikrobiote v kozom či ovčom mlieku (najmä v mlieku produkovanom na Slovensku) sú nedostatočné a ich podrobná identifikácia detajlnou sekvenačnou metódou chýbala. Možnosť získania taxonomického prehľadu o mikrobiote od úrovne fyla/kmeňa až po rody i jednotlivých zástupcov je preto originálnym prínosom nielen pre základný výskum, ale umožňuje hlavne aplikačne pracovať s prospešnými bakériami a ich bakteriocínmi (antimikrobiálnymi substanciami) teda predchádzať kontaminácii pre zachovanie zdravých potravín, a tým aj zdravia konzumentov. Štúdiom bakteriocínov sa naše pracovisko zaoberá desiatky rokov. Vyšetrené boli vzorky kozieho mlieka od 283 zvierat a vzorky 54 ovčích hrudkových syrov. V kozom mlieku dominoval fylum/kmeň Actinobacteria (62,8%), nasledovaný kmeňom Firmicutes (20, 5%), Proteobacteria (7,4%) a Bacteroidetes (6,4%). Naproti tomu v ovčom hrudkovom syre prevládal fylum Firmicutes (60, 9%), nasledovaný kmeňom Proteobacteria (38,2%), Actinobacteria (0,38%) a Bacteroidetes (0.35). Avšak, ako v kozom mlieku, tak aj v ovčom hrudkovom syre boli v rámci fyla Firmicutes najviac detegovaní zástupcovia rodu Staphylococcus. V kozom mlieku bola detegovaná široká druhová variabilita stafylokokov (MALDI-TOF spektrometria), kedy boli identifikovaní zástupcovia 14 druhov stafylokokov v rámci zachytených 37 kmeňov zo 7 identifikačných klustrov/skupín. V ovčom hrudkovom syre bolo detegovaných 5 druhov stafylokokov zo 17 kmeňov patriacich ku 3 skupinám. Tieto kmene mali len nízku schopnosť tvoriť biofilm (0,1 ≤A570 <1.0) a čo je dôležité, ich rast bol inhibovaný komerčnými lantibiotickými bakteriocínmi, gallidermín a nizín ako aj väčšinou bakteriocínov-enterocínov charakterizovaných na našom pracovisku (inhibičná aktivita do 102 400 AU/ml), čím bola zadaná možnosť využitia bakteriocínov na prevenciu v prvovýrobe mlieka, ale aj v produktoch z neho.
LAUKOVÁ, Andrea** – POGÁNY SIMONOVÁ, Monika – FOCKOVÁ, Valentína – KOLOŠTA, Miroslav – TOMÁŠKA, Martin – DVOROŽŇÁKOVÁ, Emília. Susceptibility to Bacteriocins in Biofilm-Forming, Variable Staphylococci Isolated from Local Slovak Ewes‘ Milk Lump Cheeses. In Foods, 2020, vol. 9, no. 9, art. no 1335. (2019: 4.092 – IF, Q1 – JCR, 0.660 – SJR, Q2 – SJR). ISSN 2304-8158.
Lipotoxicita ako limitujúci faktor biotechnologickej produkcie skvalénu v kvasinkách
Zsófia Csáky, Martina Garaiová, Martin Valachovič, Roman Holič, Ivan Hapala
APVV-15-0654, Vega 2/0064/16
Skvalén je triterpenoid syntetizovaný u eukaryotov ako prvý intermediát špecifický pre biosyntézu sterolov. Vďaka svojim biologickým a fyzikálno-chemickým vlastnostiam nachádza široké využitie ako potravinový doplnok aj ako surovina v kozmetickom a farmaceutickom priemysle. Vzhľadom k obmedzeným prírodným zdrojom skvalénu je jeho biotechnologická produkcia v kvasinkách komerčne zaujímavou alternatívou. Akumulovaný skvalén je v kvasinkách ukladaný do lipidových partikúl. V predchádzajúcej práci (Valachovič a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2016, 469:1123-1128) sme dokázali toxicitu akumulovaného skvalénu v kvasinke Saccharomyces cerevisiae s narušenou funkciou lipidových partikúl. Mechanizmy lipotoxicity skvalénu sme skúmali na mutantnom kmeni kvasiniek neschopnom tvoriť lipidové partikuly, u ktorého sme akumuláciu skvalénu dosiahli pomocou antimykotika terbinafínu ako špecifického inhibítora enzýmu skvalénmonooxygenázy. Zistili sme, že akumulácia skvalénu v týchto podmienkach spôsobuje narušenie funkcií plazmatickej membrány, napr. poruchy v tvorbe membránového potenciálu, zvýšenú citlivosť k osmotickému stresu a permeabilitu k fluorescenčnej próbe rodamínu 6G. Narušenie viability a permeability plazmatickej membrány je pritom úmerné množstvu akumulovaného skvalénu. Poruchy vo funkčnosti plazmatickej membrány sa teda podieľajú na mechanizmoch toxicity skvalénu v kvasinkách. Dosiahnuté výsledky ukazujú, že pri biotechnologickej produkcii skvalénu v kvasinkách je potrebné okrem maximalizácie jeho akumulácie zohľadňovať aj skladovaciu kapacitu lipidových partikúl. Skúmanie toxicity skvalénu v kvasinkách môže tiež prispieť k objasneniu mechanizmov fungicídneho účinku terbinafínu ako klinicky široko využívaného antimykotika.
CSÁKY, Zsófia – GARAIOVÁ, Martina – KODEDOVÁ, Marie – VALACHOVIČ, Martin – SYCHROVÁ, Hana – HAPALA, Ivan. Squalene lipotoxicity in a lipid droplet-less yeast mutant is linked to plasma membrane dysfunction. In Yeast, 2020, vol. 37, iss. 1, p. 45-62. (2019: 3.143 – IF, Q2 – JCR, 1.382 – SJR, Q1 – SJR). ISSN 0749-503X.
Vplyv mutácií v SCN1A géne na funkčné vlastnosti sodíkového kanála u pacientov s epilepsiou
Ľubica Lacinová, Bohumila Jurkovičová Tarabová
SCN1A, gén kódujúci α1 podjednotku napäťovo závislého sodíkového kanála NaV1.1, je spojený s rozvojom rôznych typov epilepsie. Mutácie v tomto géne spôsobujú závažné epileptické ochorenia ako je Dravetov syndrom. Priebežné štúdie pacientov identifikovali viaceré nové varianty SCN1A génu, ktorých vplyv na priebeh ochorenia nie je známy. V tejto práci sme sledovali vplyv deviatich mutácií na funkciu NaV1.1 kanála exprimovaného v HEK 293 bunkovej línii. Elektrofyziologické merania ukázali, že štyri z mutácií, E78X, W384X, E1587K a R1596C, spôsobili kompletnú stratu funkcie kanála a teda nulový sodíkový prúd . Mutácie E788K a M909K viedli k čiastočnej strate funkcie kanála. Pozorovali sme pokles prúdovej hustoty, zmeny v kinetike aktivácie a inaktivácie sodíkového prúdu, a spomalenie zotavenia kanála z inaktivácie. Mutácia D249E spôsobila posun aktivačnej a inaktivačnej krivky sodíkového prúdu k negatívnejším transmembránovým napätiam a spomalenie zotavenia kanála z inaktivácie. Podobné spomalenie zotavenia z inaktivácie sme zistili aj v experimentoch s mutáciami E78D a T1934I, pričom mutácia T1934I spôsobovala aj pokles prúdovej hustoty. Naše funkčné in vitro analýzy potvrdili, že mutácie spôsobujúce kompletnú stratu funkcie kanála sú spojené s najzáväznejšími priebehmi ochorenia. Naopak, missense mutácie, ktoré iba mierne modifikujú sodíkový prúd, sú spojené s miernejšími prejavmi u pacientov. Preto pochopenie molekulárnych mechanizmov epilepsie je predpokladom pre správne nastavenie liečby.
KLUČKOVÁ, Daniela – KOLNÍKOVÁ, Miriam – LACINOVÁ, Ľubica – JURKOVIČOVÁ TARABOVÁ, Bohumila – FOLTAN, Tomáš – DEMKO, Viktor – KÁDAŠI, Ľudevít – FICEK, Andrej – ŠOLTÝSOVÁ, Andrea**. A Study among the Genotype, Functional Alternations, and Phenotype of 9 SCN1A Mutations in Epilepsy Patients. In Scientific Reports, 2020, vol. 10, no. 1, art. no. 10288. (2019: 3.998 – IF, Q1 – JCR, 1.341 – SJR, Q1 – SJR, karentované – CCC). ISSN 2045-2322.
Expresia a distribúcia CD151 ako partnera alpha6 integrínu na samčích gamétach.
Jana Jankovičová, Petra Sečová, Ľubica Horovská, Katarína Michalková, Jana Antalíková
VEGA-2/0027/20, APVV15-0196 a SAV- AV ČR (18-17)
Analýzou tetraspanínovej siete v procesoch súvisiacich s oplodnením sa nám ako prvým v spolupráci s Laboratóriom reprodukčnej biológie Biotechnologického ústavu AV ČR v Prahe podarilo zistiť prítomnosť tetraspanínu CD151 na cicavčích spermiách. Tetraspanín je lokalizovaný na spermiách počas ich vývinu v semenníku, v období dozrievania v nadsemenníku a aj po ejakulácii. Lokalizácia CD151 na spermiách nie je druhovo špecifická, na rozdiel od tetraspanínov CD9 a CD81, ktorých dôležitosť v procese oplodnenia už bola preukázaná. CD151 sme detegovali v tzv. ekvatoriálnej oblasti vnútornej akrozómovej membrány spermie (myšej, býčej a ľudskej), ktorá je z hľadiska fúzie gamét kľúčovým miestom. Na myších spermiách sme zároveň potvrdili interakciu CD151 s integrínovou podjednotkou α6. Tieto zistenia rozširujú súčasné poznatky o štruktúre a dynamike multimolekulárnych komplexov pôsobiacich v jednotlivých procesoch reprodukcie, ktoré sme spracovali v dvoch prehľadných článkoch.
JANKOVIČOVÁ, Jana* – FROLÍKOVÁ, Michaela* – PÁLENÍKOVÁ, Veronika – VALÁŠKOVÁ, Eliška – ČERNÝ, Jiří – SEČOVÁ, Petra – BARTÓKOVÁ, Michaela – HOROVSKÁ, Ľubica – MAŇÁSKOVÁ-POSTLEROVÁ, Pavla – ANTALÍKOVÁ, Jana** – KOMRSKOVÁ, Kateřina**. Expression and distribution of CD151 as a partner of alpha6 integrin in male germ cells. In Scientific Reports, 2020, vol. 10, no. 1, art. no. 4374. (2019: 3.998 – IF, Q1 – JCR, 1.341 – SJR, Q1 – SJR, karentované – CCC).
JANKOVIČOVÁ, Jana* – NEUEROVÁ, Zdeňka* – SEČOVÁ, Petra – BARTÓKOVÁ, Michaela – BUBENÍČKOVÁ, Filipa – KOMRSKOVÁ, Kateřina – POSTLEROVÁ, Pavla – ANTALÍKOVÁ, Jana**. Tetraspanins in mammalian reproduction: spermatozoa, oocytes and embryos. In Medical Microbiology and Immunology, 2020, vol. 209, no. 4, p. 407-425. (2019: 1.961 – IF, Q3 – JCR, 0.860 – SJR, Q1 – SJR). ISSN 0300-8584.
JANKOVIČOVÁ, Jana – SEČOVÁ, Petra – MICHALKOVÁ, Katarína – ANTALÍKOVÁ, Jana**. Tetraspanins, More than Markers of Extracellular Vesicles in Reproduction. In International Journal of Molecular Sciences, 2020, vol. 21, no. 20, art. no. 7568. (2019: 4.556 – IF, Q1 – JCR, 1.317 – SJR, Q1 – SJR, karentované – CCC). (2020 – Current Contents, WOS, SCOPUS). ISSN 1422-0067.
Úloha adiponektínu v regulácii transportu glukózy do skorých embryí a embryonálnych karcinómových buniek
Ján Burkuš, Janka Babeľová, Alexandra Špirková, Martina Kšiňanová, Veronika Kovaříková, Juraj Koppel, Dušan Fabian, Štefan Čikoš
APVV-18-0389, VEGA 2/0092/19, DAAD (Germany) – SAV (Slovakia) Hormonal dysregulations in a diabetic pregnancy, German Research Foundation GRK 2155 PromoAge, EU COST Action FA1201 Epiconcept.
Skoré embryá začínajú od štádia blastocysty (tesne pred implantáciou do steny maternice) používať ako hlavný zdroj energie glukózu, ktorej transport do embryonálnych buniek môže byť regulovaný aj signálnymi molekulami z materského organizmu. V našej práci sme skúmali, či adiponektín, proteín sekretovaný materským tukovým tkanivom, môže ovplyvniť transport glukózy do embryonálnych buniek. Na modeli myšacích blastocýst sme zistili, že adiponektín stimuluje vstup glukózy do buniek embrya, pričom dochádza k presunu glukózového transportéra GLUT8 k bunkovej membráne. Pre podrobnejšie skúmanie adiponektínovej signalizácie sme použili embryonálne telieska vytvorené z myšacích embryonálnych karcinómových buniek línie P19, u ktorých sme preukázali, že adiponektín stimuluje vstup glukózy do buniek rovnako ako u blastocýst. Naše výsledky ukázali, že potenciálnou cieľovou molekulou adiponektínovej signalizácie je okrem kinázy AMPK aj kináza p38MAPK, pričom tieto dve signálne dráhy prebiehajú pravdepodobne nezávisle. Pôsobenie adiponektínu môže nadobúdať na význame v prípade nedostatku inzulínu, pričom adiponektín môže udržať adekvátny prísun glukózy do skorého embrya, napríklad u matiek s diagnózou diabetes mellitus 1. typu.
BURKUŠ, Ján* – NAVARRETE-SANTOS, A – SCHINDLER, M. – BABEĽOVÁ, Janka – JUNG, JS – ŠPIRKOVÁ, Alexandra – KŠIŇANOVÁ, Martina – KOVAŘÍKOVÁ, Veronika – FISCHER, B. – KOPPEL, Juraj – FABIAN, Dušan – ČIKOŠ, Štefan**. Adiponectin stimulates glucose uptake in mouse blastocysts and embryonic carcinoma cells. In Reproduction, 2020, vol. 159, no. 3, p. 227-239. (2019: 3.206 – IF, Q2 – JCR, 1.201 – SJR, Q1 – SJR). ISSN 1470-1626.
Zriedkavá mutácia v CACNA1H géne u pacientov s amyotrofickou laterálnou sklerózou spôsobuje kompletnú stratu aktivity Cav3.2 vápnikového kanála
Bohumila Jurkovičová Tarabová, Ľubica Lacinová
VEGA 2/0143/19, SAS-CAS project (SAV-18-22)
Amyotrofická laterálna skleróza (ALS) je neurodegeneratívne ochorenie prejavujúce sa postupnou degeneráciou kortikálnych, spinálnych a mozgovokmeňových motorických neurónov, vedúcou k ochabovaniu svalstva a paralýze. Gén CACNA1H kódujúci CaV3.2 vápnikový kanál patrí ku génom zvyšujúcim predispozíciu pre rozvoj ALS. V tejto práci sme charakterizovali funkčné vlastnosti dvoch nových variantov CACNA1H génu, c.454GTAC > G a c.3629C > T, ktoré boli identifikované sekvenovaním celého genómu malej skupiny ALS pacientov. Delécia vysokokonzervovaného izoleucínu 153, ΔI153, v druhom transmembránovom segmente CaV3.2 vápnikového kanála vo variante c.454GTAC > G sa prejavila úplnou stratou funkcie kanála. Navyše, mutovaný variant mal dominantný negatívny účinok na wild-type variant kanála pri ich spoločnej expresii v bunkovej línii. Druhý variant c.3629C > T s missense zámenou prolínu za leucín, p.P1210L, sa prejavil miernejšou zmenou aktivity CaV3.2 kanála. Mutácia c.454GTAC > G je prvou známou patologickou mutáciou CaV3.2 kanála, ktorá vedie k úplnej strate funkcie kanála. Výsledky práce ukazujú, že mutácie CaV3.2 kanála, ktoré vedú k potlačeniu vápnikového prúdu, môžu byť rizikovými faktormi pri rozvoji ochorenia ALS.
STRINGER, Robin N. – JURKOVIČOVÁ TARABOVÁ, Bohumila – HUANG, Sun – HAJIGHASSEMI, Omid – IDOUX, Romane – LIASHENKO, Anna – SOUZA, Ivana A – RZHEPETSKYY, Yuriy – LACINOVÁ, Ľubica – VAN PETEGEM, Filip – ZAMPONI, Gerald W. – PAMPHLETT, Roger – WEISS, Norbert**. A rare CACNA1H variant associated with amyotrophic lateral sclerosis causes complete loss of Ca(v)3.2 T-type channel activity. In Molecular Brain, 2020, vol. 13, iss. 1, art. no. 33. (2019: 4.686 – IF, Q1 – JCR, 1.945 – SJR, Q1 – SJR). ISSN 1756-6606.